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細(xì)胞接收后的處理：
4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。
英文簡(jiǎn)稱
規(guī)格
貨號(hào)
ES-E14TG2a
1×106
P-X11261
產(chǎn)品詳情：
細(xì)胞別稱；ES-E14TG2a；小鼠胚胎干細(xì)胞
種屬來(lái)源；小鼠
組織來(lái)源；胚胎
生長(zhǎng)特性；貼壁生長(zhǎng)
細(xì)胞形態(tài)；球形克隆細(xì)胞樣
細(xì)胞代數(shù)；10代以內(nèi)
背景簡(jiǎn)介；ES-E14TG2a細(xì)胞缺乏HGPRT（HPRT），并且對(duì)0.06 mM的6-硫鳥嘌呤有抗性。當(dāng)在飼養(yǎng)層（胚胎成纖維細(xì)胞或STO細(xì)胞）上培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞保持未分化狀態(tài)。在沒有飼養(yǎng)層的情況下，細(xì)胞自發(fā)分化并形成胚胎結(jié)構(gòu)。當(dāng)注入胚泡中時(shí)，細(xì)胞可以進(jìn)入生殖系。在常規(guī)的分子基因修飾技術(shù)之后，它們可用于重構(gòu)小鼠胚胎。
細(xì)胞規(guī)格；1x106cells/T25或1mL凍存管
支原體檢測(cè)；無(wú)
培養(yǎng)基；DMEM+15%FBS+1%L-Glu+1%NEAA+1%丙酮酸鈉+1uL/mLβ-Me+0.1uL/mLLIF+1%雙抗
培養(yǎng)條件；氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃
凍存條件；無(wú)血清凍存液，液氮儲(chǔ)存
1）收到細(xì)胞后，75%酒精瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。
2）請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。
3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。
干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞
（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。
1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二．細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜
。天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25瓶為例：
1、細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/ml.
2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3、將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
實(shí)驗(yàn)原理：
公司正在出售的產(chǎn)品：
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MPDU1蛋白抗體 |
大鼠白介素33(IL-33)elisa分析檢測(cè)試劑盒 |
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MPDU1 |
PP2A蛋白表達(dá)ELISA定量檢測(cè)試劑盒 |
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上皮鈣粘附分子結(jié)合蛋白E7 |
大鼠脂蛋白關(guān)聯(lián)磷脂酶A2(LpPLA2)elisa檢測(cè)試劑盒 |
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Ecadherin binding protein E7 |
小鼠δ樣蛋白1源物(δLK1)elisa檢測(cè)試劑盒 |
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犬促腎上皮質(zhì)釋放(CRH)elisa分析檢測(cè)試劑盒 |
Arf6鳥苷酸酶活性分析試劑盒 |
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血液乙醛脫氫酶2活性比色法定量檢測(cè)試劑盒 |
微管相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶1抗體 SAST124 |
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小鼠賴氨酰氧化酶(LOX)elisa檢測(cè)試劑盒 |
細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1抗體 ASK1 |
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大鼠泛素結(jié)合酶UBC5 elisa分析檢測(cè)試劑盒 |
SKIP蛋白抗體 SKIP |
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痙攣性截癱相關(guān)蛋白20抗體 SPG20/Spartin |
TIP60抗體 KAT5 / Tip60 |
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有絲分裂著絲粒蛋白F抗體 CENPF |
AF680標(biāo)記的LAD1蛋白抗體 LAD1, Alexa Fluor 680 conjugated |
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載脂蛋白M抗體 ApoM |
AF750標(biāo)記的環(huán)氧合酶2/前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2抗體 Cyclooxygenase 2, Alexa Fluor 750 conjugated |
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紡錘體組裝異常蛋白6抗體 SASS6 |
結(jié)腸癌相關(guān)蛋白Mic1抗體 MIC1 |
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富含亮氨酸膠質(zhì)瘤失活蛋白2抗體 LGI2 |
HERC3 E3泛素蛋白連接酶抗體 HERC3 |
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G蛋白偶聯(lián)受體73A抗體 GPR73A |
小鼠胚胎干細(xì)胞;ES-E14TG2a鳥苷酸調(diào)節(jié)蛋白12抗體 G protein alpha 12 |
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羥酰谷胱甘肽水解酶蛋白抗體 HAGH |
大鼠乳過氧化物酶(LPO)elisa檢測(cè)試劑盒 |
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HOECHST 33342和PROPIDIUM IODIDE細(xì)胞膜變檢測(cè)試劑盒 |
細(xì)胞KSHV（KAPOSI SARCOMA-ASSOCIATED HERPESVIRUS）病毒定性檢測(cè)試劑盒 |
實(shí)驗(yàn)步驟：
1 將目的基因構(gòu)建到合適的慢病毒載體上，利用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，獲得含目的基因的慢病毒；
2 轉(zhuǎn)染前24 h進(jìn)行細(xì)胞鋪板，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度控制在80%左右；
3 天加入適量病毒懸液感染細(xì)胞，并置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育；
4 24 h后用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)；
5 在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥篩選培養(yǎng)，直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為100%，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。