普通pcr引物設(shè)計和熒光定量pcr引物設(shè)計的區(qū)別

一、方法不同

1、普通pcr引物設(shè)計：引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。

2、熒光定量pcr引物設(shè)計：通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，標記跟蹤PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)測反應(yīng)，利用與之相適應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度

二、原理不同

1、普通pcr引物設(shè)計：為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。

2、熒光定量pcr引物設(shè)計：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過熒光信號不斷累積而實現(xiàn)實時監(jiān)測PCR全程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量PCR中，對全程PCR擴增過程進行實時檢測，根據(jù)反應(yīng)時間和熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。

三、注意事項不同

1、普通pcr引物設(shè)計：引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。引物長度在15~30堿基之間。

3、熒光定量pcr引物設(shè)計：實時熒光定量 PCR 儀應(yīng)安放在濕度較低、灰塵較少、遠離水池的平穩(wěn)臺面上，不能有強光直射，室內(nèi)應(yīng)通風良好，無腐蝕性氣體 。

假陽性是指出現(xiàn)的 PCR 擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

產(chǎn)生的原因有：

①引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行 PCR 擴增時，擴增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的序列；

②靶序列太短或引物太短；

③靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染。

解決方法有：操作輕柔，防止靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外造成污染；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材高壓消  毒；離心管及加樣槍頭等一次性使用。必要時，可在加標本前，將反應(yīng)管和試劑用紫外光照射，以破壞存在的核酸。